2、组织学研究办法

(一)普通光学显微镜术

应用普通光学显微镜(简称光镜)不雅察组织切片是组织学研究的最根本办法。取植物或人体的新鲜组织块,先用固定剂(fixative)固定(fixation),使组织中的蛋白质敏捷凝结,防止细胞自溶和组织腐烂。经常使用的固定剂如洒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等,普通常将几种固定剂配制成混淆固定液,以抵消或减弱单种固定剂对组织的紧缩或收缩等缺点,达到更好固定后果。固定后的组织块(约3~5mm3大年夜小)用白腊、火棉胶或树脂等包埋(embedding)成硬块,以切片机(microtome)切成5~10μm厚的组织切片(tissue section),切片贴在载玻片上经脱蜡等步调落先行染色。组织块也可急速投入液氮(-196℃)内快速解冻,用恒冷箱切片机(cryostat)制成冷冻切片(frozen section),这类办法制片敏捷,细胞内酶活性保存较好,经常使用于酶组织化学染色。血细胞和分别培养的细胞可直接涂在玻片上,制成涂片(smear)。松懈结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上(铺片),牙和骨等坚固组织可磨成薄片(磨片)。组织切片等标本经染色、透明后,以封固剂和盖片封固,便可经久保存,镜下不雅察。

 坚牢绿(酸性染料)与亚甲蓝(碱性染料)的化学构造及其染色反响表示

图1-1 坚牢绿(酸性染料)与亚甲蓝(碱性染料)的化学构造及其染色反响表示

染色(staining)是用染料使组织切片着色,便于镜下不雅察。天然和人工分解的染料甚多,它们都是含发色团的无机化合物,当染料具有助色团成为盐类物质,便可融化于水并具电荷,与组织有亲协力,使组织着色。含氨基(-NH2)、二甲氨基〔-N(CH32〕等碱性助色团的染料,称碱性染料(basic dye),它的盐溶液具阳电荷;含羧基(-COOH)、羟基(-OH)或磺基(-SO3H)等酸性助色团的染料,称酸性染料(acid dye),它的溶液具阴电荷(图1-1)。组织的染色道理普通认为基于化学结合或物理吸附感化。细胞和组织的酸性物质或构造与碱性染料亲协力强者,称嗜碱性(basophilia);而碱性物质或构造与酸性染料亲协力强者,称嗜酸性(acidophilia);若与两种染料的亲协力均不强者,称中性(neutrophilia)。组织的根本成分是蛋白质,构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的,也有含羧基的,是两性电解质。各类蛋白质的等电点因氨基酸成分的不合而异,其电荷性质又与溶液的pH值相干,根据研究目标选用合适的染色办法,调剂好染液的pH值,便可取得优胜染色后果。经常使用的酸性染料如伊红、坚牢绿、橙黄G等,碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最经常使用的是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色法,简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色,伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着白色。

物理吸附感化的染色办法,如用苏丹染料显示脂肪组织,染料溶于脂肪内,使细胞内的脂滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些构造,则是使金属微粒附着在构造外面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织构造可直接使硝酸银复原而显示,称此为亲银性(argentaffin);有些构造无直接复原感化,需参加复原剂方能显色,则称为嗜银性(argyrophilia)。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖,当用甲苯胺蓝(toluidine blue)等碱性染料染色后呈紫白色,这类景象称为异染性(metachromasia),其道理能够是该染料在溶液中呈单体状况时显蓝色,当它与多阴离子的高分子物质耦合后,染料分子聚分解多聚体而显白色(图1-2)。还有些染色办法的道理至今还不清楚。

异染性表示图

图1-2 异染性表示图

(二)几种特别显微镜的应用

1.荧鲜明微镜 荧鲜明微镜(fluorescence microscope)是用来不雅察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和构造。荧鲜明微镜是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源,并配有激起、阻断、吸热和接收紫外线等滤片体系,标本中的荧光物质在紫外线激起下产生各类色彩的荧光,借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等外的脂褐素呈棕黄色荧光,肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光,某些神经内渗出细胞和神经纤维内的单胺类物质(儿茶酚胺、5-羟色胺、组胺等)在甲醛感化下呈不合色彩的荧光,组织内含有的奎宁、四环素等药物也出现必定的荧光。细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光,如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合,停止细胞内DNA含量测定。荧鲜明微镜更广泛用于免疫细胞化学研究,即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体(一抗或二抗),用该标记抗体直接或直接地与细胞内的照应抗原结合,以检测该抗原的存在与分布。

2.相差显微镜 相差显微镜(phase contrast microscope)是用于不雅察组织培养中活细胞形状构造的。活细胞无色透明,普通光镜下不容易分辨细胞轮廓及其构造。相差显微镜的特点是将活细胞不合厚度及细胞内各类构造对光产生的不合折射感化,转换为光密度差别(明暗差),使镜下构造反差明显,影象清楚。组织培养研究经常使用的是颠倒相差显微镜(inverted phase contrast microscope),它的光源和聚光器在载物台的上方,物镜在载物台的下方,便于不雅察贴附在培养器皿底壁上的活细胞。

3.暗视野显微镜 暗视野显微镜(dark-field microscope)重要用于不雅察因反差或分辨力缺乏的渺小颗粒。此种显微镜主如果有一个暗视野集光器,使光线不直接进入物境,故呈暗视野。而标本内的小颗粒产生的衍射光或散射光进入物镜,暗视野中的颗粒呈通亮小点,好像在暗室可见一束光线中的渺小尘粒普通。浅显通光镜最大年夜分辨率为0.2μm,暗视野显微镜则可分辨0.004~0.2μm的微粒,实用于不雅察细胞外线粒体活动及标本中细菌等微粒的活动等。

4.共集激光扫描显微镜 共焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源,光束经聚焦后落在样品(组织厚片或细胞)不合深度的渺小一点,并作移动扫描,经过过程电旌旗灯号黑色显像,经过微机图象分析体系停止二维和三维分析处理。CLSM可对细胞停止三维构造图象分析,细胞内各类荧光标记物的微量分析,细胞内Ca2+、pH值等的静态分析测定,细胞的受体移动、膜电位变更、酶活性和物质转运的测定,并以激光对细胞及其染色体停止切割、分别、挑选和克隆。是以,CLSM是一种高技巧产品,可对细胞的多种功能停止全主动、高效、快速的微量定性和定量测定。

其他如偏鲜明微镜用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质,紫外鲜明微镜用于研究细胞内核酸的分布与定量等。

(三)组织化学和细胞化学术

组织化学(histochemistry)和细胞化学(cytochemistry)技巧是经过过程化学或物理反响道理显示组织切片细胞内某种化学成分,停止定位、定量及其与功能相干的研究。如糖类、脂类、酶、核酸等与试剂产生化学物理反响,构成有色终末产品,在光镜下不雅察,有的可在电镜下不雅察。

1.糖类显示多糖和蛋白多糖的经常使用办法是过碘酸-雪夫反响(periodic acid Schiff reaction,PAS反响)。基来源基本理是过碘酸的氧化感化先使糖分子的乙二醇基变成乙二醛基,后者继而与Schiff试剂(无色亚硫酸品红复合物)结合,构成紫白色反响产品(图1-3)。色彩反响的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。

PAS反响道理表示图

图1-3 PAS反响道理表示图

2.脂类脂类物质包含脂肪和类脂。标本用甲醛固定,冷冻切片,脂类保存较好。多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色,使脂质呈色。也可用四氧化锇(OSO4)染色,脂肪酸或胆碱可使OSO4复原为OSO2而呈黑色。

3.酶细胞内的酶种类甚多,有氧化复原酶、水解酶、分解酶、转移酶等几类,今朝已有100多种酶组织化学染色法。酶组化反响的基来源基本理是应用酶对其照应底物的水解、氧化等感化,然后再使底物的反响产品与某种捕获剂产生反响,构成沉淀或有色的终究产品,借此检测该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。如细胞的磷酸酶是一种重要的水解酶,碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)在合适的pH条件下可水解无机磷酸脂。小肠上皮细胞外面的纹状缘和肾近曲小管外面的刷状缘处,微绒毛含有丰富的ALP,与物质的接收和转运功能相干;很多细胞的溶酶体内则含大年夜量ACP,参与细胞内物质代谢。这两种酶都可以β-甘油磷酸钠为底物,底物被水解产生磷酸根,再以Ca2+、Co2+(显示ALP)或Pb2+(显示ACP)捕获磷酸根,最后用硫化铵处理,即构成硫化钴或硫化铅黑色终究产品,涌如今组织切片中该酶存在的部位。是以,酶组化染色不是酶本身的直接显色,而是酶感化底物的化学反响产品显色的。

4.核酸 显示DNA的传统办法是Feulgen反响,切片先用稀盐酸处理,使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接键翻开,构成醛基,再与Schiff 试剂感化,道理同PAS反响,使细胞核DNA显紫白色。还可用甲基绿-焦宁染色法同时显示DNA和RNA,这两种染料都是碱性,甲基绿使细胞核内的DNA呈蓝绿色,焦宁使细胞质和核仁内的RNA呈白色。

 免疫细胞化学术表示图

图1-4 免疫细胞化学术表示图

人呼吸道分别上皮细胞粘蛋白免疫荧光像

图1-5 人呼吸道分别上皮细胞粘蛋白免疫荧光像

(美国戴维斯加州大年夜学 吴忍传授供图)

(四)免疫细胞化学术

免疫细胞化学(immunocytochemistry)术是应用抗原与抗体结合的免疫学道理,检测细胞内多肽、蛋白质及膜外面抗原和受体等大年夜分子物质的存在与分布。这类办法特异性强,敏感度高,停顿敏捷,应用广泛,成为生物学和医学浩大学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛展开和标记技巧赓续进步,免疫细胞化学的停顿更是一日千里,不只用于很多根本实际的研究,并取得严重年夜冲破,并且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类单一,具有抗原性。分别纯化人或植物组织某种蛋白质,作为抗原注入另外一种植物体内,后者即产生照应的特异性抗体(免疫球蛋白)。从被免疫植物的血清中提取出该抗体,再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记,用这类标记抗体处理组织切片或细胞,标记抗体即与细胞的照应蛋白质(抗原)产生特异性结合(图1-4)。经常使用的荧光素是异硫氰酸荧光素(FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC),在荧鲜明微镜下可不雅察荧光抗体抗原复合物(图1-5)。经常使用的酶是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的),它的底物是3,3'-二氨基、联苯胺(DAB)和H2O2,HRP使DAB氧化构成棕黄色产品,可在光镜和电镜下不雅察(图1-6)。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合,也可在光镜和电镜下不雅察(图1-7)。

大年夜鼠腺垂体免疫组织化学(PAS法)示发展激素细胞

图1-6 大年夜鼠腺垂体免疫组织化学(PAS法)示发展激素细胞

(上海医科大年夜赵培林传授供图)

免疫细胞化学(蛋白A-胶体金法)和原位杂交术示大年夜鼠垂体

图1-7 免疫细胞化学(蛋白A-胶体金法)和原位杂交术示大年夜鼠垂体

催乳素细胞电镜像 N催乳素细胞核

↑渗出颗粒内显示金粒

粗面内质网(RER)显示银粒

粗面内质网(RER)显示银粒

(加拿大年夜Douglas医院研究中间童毅爱博士赠图)

标记抗体平易近被检抗原的结合方法有两种。一是直接法,即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合(图1-8)。这类办法操作简便,但敏感度不及直接法。直接法是将分别的抗体(第一抗体简称一抗)再作为抗原免疫另外一种植物,制备该抗体(抗原)的抗体(第二抗体简称二抗),再以标记物标记二抗。前后以一抗和标记二抗处理样品,终究构成抗原一抗-标记二抗复合物(图1-8)。直接法中的一个抗原分子可经过过程一抗与多个标记二抗相结合,是以它的敏感度较高,并且今朝国表里均有多种标记二抗商品供给,应用便利。直接法中较经常使用的是一种称之为过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法),该法除需一抗和二抗外,还需制备HRP标记的抗酶抗体,即以HRP作为抗原免疫植物,制成抗HRP抗体,再以HRP标记该抗体系体例成由3个酶分子与2个抗酶抗体构成的相当稳定的环形PAP复合物。标本前后以一抗、二抗和PAP复合物处理后,再以DAB显色,便可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原经过过程抗体的层层缩小年夜而与多个酶分子结合,是以敏理性很强(图1-9)。

 免疫细胞化学直接法(A)与直接法(B)表示图

图1-8 免疫细胞化学直接法(A)与直接法(B)表示图

 免疫细胞化学PAP法表示图

图1-9 免疫细胞化学PAP法表示图

免疫细胞化学术近10年来又有新停顿,如生物素-亲合素等新鲜试剂的应用,为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新门路。生物素(biotin)又称维生素H,是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质(分子量244.31);亲合素(avidin)又称蛋白素,是从蛋白中提取的一种糖蛋白(分子量68kD)。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点,二者可牢凝集分解弗成逆的复合物。生物素-亲合素的应用大年夜致有三种办法。①标记亲合素-生物素法(labelled avidin- biotin method,LAB法):将亲合素与标记物(HRP)结合,一个亲合素可结合多个HRP;将生物素与抗体(一抗与二抗)结合,一个抗体分子可连接多个生物素分子,抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或经过过程一抗)先与生物素化的抗体结合,继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上,如此多层缩小年夜进步了检测抗原的敏理性(图1-10)。②桥连亲合素-生物素法(bridged avidin-biotin method,BAB法):先使抗原与生物素化的抗体结合,再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接,也达到多层缩小年夜后果(图1-10)。③亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法);此法是前两种办法的改进,即先按必定比例将亲合素与酶标生物素结合在一路,构成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物),标本中的抗本来后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合,终究构成晶格样构造的复合体,个中搜集了大年夜量酶分子,从而大年夜大年夜进步了检测抗原的灵敏度(图1-10)。现有配制现成的ABC药盒商品供给,操作简便,是今朝广泛应用的一种办法。

生物素-亲合素免疫细胞化学表示图

图1-10 生物素-亲合素免疫细胞化学表示图

(1)标记亲合素-生物素法

(2)桥连亲合素-生物素法

(3)亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC法)

(五)同位素示踪术

同位素示踪术是用放射性核素的射线感化,研究细胞对某种物质的接收、分解、转运和渗出等代谢过程。将放射性核素或其标记物注入植物体内或参加细胞培养的培养基内,细胞摄取该物质后,取被检组织制成切片或细胞涂片。可用显微镜放射自显影术(microau toradiography)检测该放射性物质在细胞内的原位分布及其代谢转归,行将薄层感光乳胶涂在切片或涂片的外面,标本在暗盒内保存一准时间后,细胞内的放射性核素产生的射线使乳胶中的溴化银复原为银粒,经显影和定影后在光镜下不雅察银粒的分布。β射线能量低,射程短,电离感化强,经常使用的β射线核素是3H、14C、32P、35S、45Ca、131I。如用3H-胸腺嘧啶核苷研究细胞DNA分解及细胞增殖静态(图1-11)。用35S-蛋氨酸研究某些腺细胞渗出物的分解与渗出,用131I-碘化钠研究甲状腺素的分解等。还可做标本中的银粒数计量或其光密度测定,停止定量分析。别的,也可用液体闪烁计数器测定分别细胞或其匀浆的放射线强度,停止定量研究。

(六)原位杂交术

原位杂交术(in situ hybridization)是一种核酸分子杂交技巧,它是经过过程检测细胞内mRNA和DNA序列片段,原位研究细胞分解某种多肽或蛋白质的基

大年夜鼠肝大年夜部切除后再生过程当中增殖期肝细胞

图1-11 大年夜鼠肝大年夜部切除后再生过程当中增殖期肝细胞

摄取3H标记的胸腺嘧啶核苷放射自显影象

↑ 增殖期肝细胞核

因表达。其基来源基本理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专注配对的特点,应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针(probe),与组织切片或细胞内的待测核酸(RNA或DNA片段)停止杂交,经过过程标记物的显示,在光镜或电镜下不雅察目标mRNA或DNA的存在与定位。此项技巧需起首制备某种核酸探针,其种类重要有三种:①应用大年夜肝杆菌重组带有目标基因的质粒DNA,制成互补DNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板,在体外转录取得反意RNA探针(cDNA);③按照待测核酸的核苷酸序列,应用DNA分解仪分解寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的经常使用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主如果染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达;后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达(图1-7,1-12)。核酸分子杂交术有很高的敏理性和特异性,它是免疫细胞化学的基本上,进一步从分子程度商量细胞功能的表达及其调理机制的,已成为以后细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。

原位杂交术光镜像

图1-12 原位杂交术光镜像

A 32P标记胰岛素cRNA探针放射自显影显示大年夜鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNa

B 地高辛-碱性磷酸酶标记胰岛素cRNA探针显示大年夜鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNA

C 地高辛-碱性磷酸酶标记心钠素cRNA探针显色示体外培养的人胎儿脐静脉

内皮细胞内的心钠素mRNA ×850

(第全军医大年夜学蔡文传授供图)

(七)细胞和细胞化学定量术

组织和细胞形状构造及其化学成分的定量研究,是以量的测定及其数据变更阐述组织和细胞的发展、分化、代谢和功能的演变和对情况身分和致病身分的反响。生命迷信的研究赓续深刻,定量技巧的应用日趋广泛并有所停顿。

1、显微镜分光亮度定量术此办法是应用显微分光亮度计(microspectrophotometer)测定组织化学和免疫组织化学染色标本的反响强弱,停止化成分的定量分析的。基来源基本理是细胞内某种物质的含量不合,其染色反响的深浅不一,对必定波长的光接收也就不合,即某物质的消亮度与必定厚度和面积内的该物质浓度成正比。经过过程光电组合主动控制体系将消光度转换为电旌旗灯号,便可得出光密度值(O、D值),停止定量分析比较。前述荧光素染色、酶和核酸组织化学染色、多肽和蛋白质免疫组化染色、放射自显影和原位杂交等标本,都可应用显微分光光度计做定量分析。

2、形状计量术 形状计量术(morphometry)是应用数学和统计学道理对组织和细胞停止二维和三维的形状丈量研究,如细胞及其微细结构成分的数量、体积、外面积、周长等的相对和相对值的丈量,个中三维平面构造的研究又称体视学(stereology)。机体组织的光镜构造计量已有很多成心义的材料,如人和植物的肺泡数量和外面积,肾小体的数量和体积比,肝细胞的体积和数量,胰岛的数量及各类细胞的数量比,腺垂体各类内渗出细胞的数量比等。经过过程组织切片或照片(光镜和电镜)平面图象的丈量,推算其平面构造数值,传统办法是将测试体系(点、线、方格等)投影或覆盖在切片上或照片上,把若干样品的平面丈量数据按数学公式推算出其平面数值。今朝已广泛应用图象分析仪(image analyzer)停止形状计量研究,该仪器也是光学、电子学和计算机高技巧产品,它是将切片或照片图象经过过程摄像机显示于监示器屏幕上,并根据不合构造的色彩深浅(灰度)及各像点的大年夜小地位,快速精确地得出所需的各类形状数据。组织化学和免疫组织化学染色标本,也可应用图象分析仪测定其光密度值,停止定量分析。

3、流式细胞术 流式细胞术(flow cytometry,FCM)是近年建立的细胞分类和定量研究技巧,它是应用流式细胞仪(或称荧光激活细胞分类器,fluroescent activated cell sorter)对单个细胞生物化学和生物物理特点停止快速定量测定的。任务道理是先分别被检细胞制成悬液,并作荧光染色或标记,使单细胞液流快速经过过程该仪器的激光器照射分析区,被检细胞产生的不合荧光旌旗灯号改变成电脉冲,分别输入计算机内贮存,并显示于示波器屏幕上,便可取得该细胞群体中不合类型细胞的有关数据,如不合细胞的数量、荧光强度和细胞体积、外面积和外部构造等参数;还可使细胞附有不合电荷,分类搜集各类细胞,该技巧的特点是速度快,精确性高,灵敏度大年夜,已成为一种重要手段广泛用于细胞动力学、遗传学、免疫学、肿瘤学等的研究。如细胞DNA,RNA或某种蛋白质的含量分析,单个染色体DNA含量及分选,淋巴细胞膜抗原或受体的分析及细胞亚群分选,杂交细胞等的分选等,也用于肿瘤临床诊断及疗效和预后的分析等。

(八)电子显微镜术

1、透射电镜术 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)是以电子束穿透样品(组织的超薄切片),经聚合缩小年夜后,显像于荧光屏长停止不雅察和摄片的。电镜的缩小年夜倍数的分辨率比光镜大年夜很多,缩小年夜倍数为几万至几十万倍,分辨率可达0.2nm。标本制备较光镜的更严格,新鲜组织切成小块(lmm3),用戊二醛,多聚甲醛、四氧化锇等固定,树脂包埋,以超薄切片机切成厚50~80nm的超薄切片,经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后,置于电镜下不雅察,标本在荧光屏上呈诟谇反差的构造影象。被重金属浸染呈黑色的构造,称电子密度高(electron-dense);反之,浅染的部分称电子密度低(electron-lucent),这类染色称正染色(positive staining)。若被染构造着色浅淡,而其四周部分染成黑,是称为负染色(negative stainning)。透射电镜的电子枪加快电压50~100kV,电子束穿透力低,近年制成加快电压500kV以上的超高压电镜,电子束穿透力很强,可不雅察0.5~10μm厚的切片,可不雅察细胞内骨架等的平面超微构造。应用电镜不雅察细胞化学染色标本,称电镜细胞化学术(electron microscope cytochemistry);电镜不雅察免疫细胞化学染色标本,称免疫电镜术(immunoelectron microscopy);电镜与放射自显影结合的办法称电镜放射自显影术(electron microscopeautoradiography)。

2、扫描电镜术 扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)是用于不雅察组织外面的平面构造的。组织块经固定后,置于真空镀膜仪内于燥,在标本外面前后喷镀一层碳膜和合金膜,便可置于镜下不雅察。扫描电镜的景深长,样品外面的金属膜可进步其导电性和图象反差,在荧光屏上扫描成像,出现富有平面感的外面图象,如细胞外面的崛起、微绒毛、纤毛及细胞的渗出与吞噬行动等(图1-13)。

 大年夜鼠分别肝巨噬细胞粘着吞噬羊红细胞扫描电镜像

图1-13大年夜鼠分别肝巨噬细胞粘着吞噬羊红细胞扫描电镜像

M肝巨噬细胞,R羊红细胞

 冷冻蚀刻标本制备表示图

图1-14 冷冻蚀刻标本制备表示图

 细胞单位膜从中心层劈开表示图

图1-15 细胞单位膜从中心层劈开表示图

3、冷冻蚀刻复型术和冷冻切断术

冷冻蚀刻复型术(tfeeze etch replica):是在透射电镜下不雅察组织或细胞断裂面的金属复制膜,显示细胞微细构造的平面影象。组织块先经甘油心思盐水处理(防止构成冰晶)后投入液氮快速冷冻,在高温下用钢刀将样品劈开,构成凹凸不平的断裂面:-100℃真空下使断裂面的冰晶升华,裸露不平整外面;在断裂面上前后喷镀一层合金膜和碳膜,用次氯酸等组织腐化掉落;将反差的凸凹不平的金属复型膜置于镜下不雅察(图1-14)。此项技巧尤实用研究生物膜的外部构造,如从单位膜的脂质分子疏水端劈开(图1-15),经蚀刻镀膜,镜下可见质膜断裂面复型膜构造状况(图1-16),其凹凸影象恰与实物相反。

小鼠肾近曲小管微绒毛冷冻蚀刻复型电镜像

图1-16小鼠肾近曲小管微绒毛冷冻蚀刻复型电镜像 ×38300

MV微绒毛 E E面,P P面(白求恩医科大年夜学尹昕、朱秀雄传授供图)

冷冻切断术(freeze cracking):是将固定组织包埋在树脂内,高温下切断,断面喷镀合金,在扫描电镜下不雅察断面的平面构型。该技巧适于研究组织外部微细构造的相互关系,如肝细胞与肝血窦和怯弱管的关系,肾小体的肾小囊与血管球的关系等(图1-17)。

大年夜鼠肾冷冻切断扫描电镜示肾小体

图1-17 大年夜鼠肾冷冻切断扫描电镜示肾小体

R肾小囊外外面,G血管球,T肾小管

(白求恩医科大年夜学尹昕、朱秀雄传授供图)

4、电镜X-射线显微分析术X-射线显微分析术(X-ray microanalysis)是研究细胞和组织内元素的种类、分布和含量的新技巧。它是应用高速电子束轰击电镜内生物标本的渺小区域,使该区所含的元素发射了必定波长的X-射线,经过过程检测器对X-射线停止波谱或能谱分析,便可测定微区内元素的性质、含量和分布。如测定细胞内Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布变更,商量各类元素与细胞心思和病理的关系。

(九)组织培养术

前述几种办法都是取人体或在体(in vivo)实验植物的组织,经固定等处理后,对已逝世亡的组织停止不雅察研究的。组织培养(tissue culture)或称体外实验(in vitro)则是取活组织或活细胞在体外合适的情况中培养成活,停止实验研究。细胞在体外生计必须具有近似体内的生计条件,如充分养分供给,公道的O2与CO2比例,须要的电解质和合适的渗透渗出压,pH值、温度和湿度等,还需防止微生物污染。组织培养的特点在于可用研究各类理化因子(温度、激素、药物、毒物等)对活细胞的直接影响,并能不雅察记录(摄影、录相)。组织培养与前述办法结合应用,可研究某种身分对细胞增殖、分化、代谢、活动、吞噬、渗出等影响和调理的静态过程,和细胞病变、癌变和逆转等机理,取得在体实验难达到的研究目标。

组织培养用液为均衡盐水及血清(小牛血清、胎盘血清等),羊水、腹水、组织浸出液等天然培养基(natural medium)。天然培养基成分复杂,且不稳定。今朝广泛应用人工分解培养基(synthetic medium)现有多种商品供给,应用便利,但常仍需弥补部分血清等。若仅用分解培养基和已制备好的几种必须因子与激素,称此为无血清培养基(serum-free medium),其成分和含量均是已知的,可精细研究某种因子对细胞的生物效应。

组织培养的办法甚多,经常使用容器有凹玻片、培养皿、培养瓶、培养板、活动小室等。取组织块贴于瓶底停止培养,可不雅察从组织块发展迁徙出的细胞。取胚胎某器官原基或器官的一部分停止培养,称器官培养(organ culture)。更精细的办法是分别和纯化组织中的某种细胞,使之贴附在瓶底构成单层细胞(图1-18),称此为细胞培养(cell culture)。初次培养的细胞,称原代培养(primary cultrue;细胞增殖而密集再传代培养,称传代培养(subculture)。阅经久培养而成的细胞群体,称细胞系(cell line);用细胞克隆(cell clone)或单细胞培养而建成的某种纯细胞群体,称细胞株(cell strain)。它们都可在液氮内经久冻存,供随时应用。现已建成多种肿瘤细胞株,广泛用于实验研究。

体外培养的上皮细胞在相差显微镜下的图象

图1-18 体外培养的上皮细胞在相差显微镜下的图象(北京肿瘤研究所鄂征传授供图)

(十)细胞融合术

2个或2个以上的细胞融分解为一个细胞,称为细胞融合(cell fusion)。正常人体内也有细胞融合景象,如两性生殖细胞结合而成受精卵,多个巨噬细胞融分解一个别积很大年夜的多核异物大小胞。体外用人工办法使两种细胞融合,制成一种新品系的杂交细胞(hybrid cell),挑选出的此种杂交细胞有很强的生命力,增殖也很旺盛。经常使用的细胞融合引诱物是仙台病毒(Sendai virus)和聚乙烯二醇(polythyleneglycol,PEG)。细胞融合术是细胞遗传术、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段,如将受抗原安慰后的小鼠脾淋巴细胞分别出来,与已建立的小鼠骨髓瘤(浆细胞瘤)细胞融合,挑选出的杂交瘤细胞可经久存活和增殖,成为制备单克隆抗体的细胞株。